Úloha virů v procesu maligní transformace

Z hlediska kancerogeneze (podrobněji popsané v kapitole Onkogenetika) je třeba viry řadit mezi biologické kancerogeny. Viry jsou nitrobuněční parazité, kteří využívají vnitřního prostředí a organel buňky k replikaci sebe sama. Během virové infekce buňky dojde k proniknutí virové částice (někdy jen některých částí; vždy proniká virová dědičná informace) do buňky, obnažení virové dědičné informace a zahájení exprese této informace. Různé viry mají různé replikační potřeby a mechanizmus replikace se u různých virů samozřejmě liší (nejmarkantnější rozdíly jsou např. mezi DNA a RNA viry). V každém případě však virová dědičná informace a virové proteiny představují cizorodé molekuly, které mohou reagovat s buněčnými proteiny i buněčným genomem. Tato interakce může mít různé následky, vzhledem k tématu práce se budeme dále soustředit na mechanizmy, kterými virová infekce může spustit proces maligní transformace.

Pro retroviry je typický následující postup při replikaci. Virová RNA je přepsána specifickou RNA-dependentní DNA-polymerázou (reverzní transkriptázou) do DNA (dvouvláknové). Jako ostatní DNA polymerázy potřebuje i reverzní transkriptáza pro syntézu primer - za tímto účelem slouží molekula tRNA, kterou si retrovirus přináší s sebou v kapsidě. Tato dvouvláknová DNA je následně inkorporována do jaderného genomu hostitelské buňky jako tzv. provirus. Následné transkripce virových genů probíhají pouze pomocí enzymů hostitelské buňky.

U modelového retroviru nacházíme 3 geny (nejedná se přímo o pouhé 3 geny, jde spíše o 3 oblasti virového genomu), které označujeme gag, pol a env. Jedná se o základní genetickou informaci, která zajišťuje replikaci virové částice (gag kóduje antigenní proteiny kapsidy, pol kóduje virovou polymerázu - reverzní transkriptázu a gen env především strukturní proteiny kapsidy a virového obalu). Produkty těchto genů transformační účinek nemají.

Proto tyto retroviry mají většinou nízkou transformační aktivitu. Označují se také jako pomalu transformující retroviry. Jejich transformační účinek je způsoben náhodnou integrací proviru do buněčného genomu, kde naruší sekvenci nějakého buněčného protoonkogenu. Vlastní mechanismus transformace je pak způsoben silným virovým promotorem, který aktivuje transkripci (a tím pádem i zvýšenou expresi) příslušného protoonkogenu (který již nyní vystupuje jako onkogen).

Existují však i retroviry, v jejichž genomu se nachází další gen - označovaný jako src. Toto označení pochází od viru Rousova sarkomu, u kterého byl poprvé tento extra gen objeven. Tento gen není důležitý pro vlastní replikaci viru a jeho případné mutace replikační cyklus nikterak neovlivňují. Podobných genů bylo později objeveno mnohem více - viz dále.

Během dalšího výzkumu se zjistilo, že v buněčném genomu (je třeba podotknout, že jde o buňky organizmu, na který má příslušný virus primární transformační účinek - u Rousova sarkomu jde například o kuřata) existují homologní úseky k těmto virovým genům. Tak byly objeveny buněčné protoonkogeny (původ těchto genů je opravdu buněčný a do virového genomu se dostává při chybném "vyštěpení z buněčného genomu; jde o podobný mechanismus šíření genetické informace jakým je transdukce bakteriálních buněk pomocí bakteriofágů). V kontextu virové transformace potom o buněčném protoonkogenu mluvíme jako o c-src (obecně c-onc) a o jeho virové formě jako v-src (obecně v-onc). Jest třeba připomenout, že buněčné (proto)onkogeny jsou standardní součástí buněčného genomu a mají introny (na rozdíl od virových onkogenů, které introny nemají).

Virové onkogeny vykazují určité rozdíly ve svých sekvencích (jak již bylo řečeno, exprese těchto genů neovlivňuje replikační cyklus viru, a tak mutace těchto genů mají minimální selekční tlak; buněčné (proto)onkogeny naopak mají vysoce konzervativní sekvence); často v nich (či v jejich blízkosti) nacházíme variabilní repetitivní sekvence, které se zde vytvořily během formování proviru (tyto sekvence se nacházejí i v jiných genových oblastech proviru). Obecně se tyto sekvence označují jako LTR (long terminal repeats) a označují aktivní promotorová místa s enchancerovou aktivitou.

Virový onkogen integrovaný do buněčného genomu představuje nadbytečnou sekvenci buněčného (proto)onkogenu. Tato nadbytečná kopie by již sama od sebe mohla mít transformační aktivitu, která je ovšem umocněna silným virovým promotorovým místem a případně i mutovanou sekvencí. Retroviry s takovýmito geny mají značnou transformační aktivitu, proto je označujeme jako rychle (rapidně) transformující retroviry.

Následující seznam obsahuje některé nejznámější (rychle transformující) retroviry a jejich virové onkogeny.

Kromě onkogenních retrovirů se setkáváme i s dalšími RNA i DNA viry, které mají vliv na transformaci buňky. Stejně jako u retrovirů se může virová genetická informace integrovat do buněčného genomu a narušit tak sekvenci některého buněčného (proto)onkogenu (tato "taktika" je častá například při virové infekci nepermisivních buněk, ve kterých virus nemůže dokončit svůj replikační cyklus a namísto toho v buňce perzistuje). Dále se zde však uplatňuje řada dalších transformačních mechanizmů.

Jmenujme například interakci produktů virových genů s buněčnými tumor-supresorovými geny (respektive jejich produkty), které jsou touto interakcí inaktivovány, čímž se otevírá cesta transformačnímu procesu (uveďme si alespoň inaktivaci p53 a p105-Rb proteinu u infekcí vyvolaných některými variantami lidského papillomaviru). Virové proteiny mohou interagovat i se základními regulačními proteiny buněčného cyklu (cykliny a CD-kinázami); případně mohou přímo ovlivňovat transkripci a tím i expresi určitých buněčných genů (obojí opět ve smyslu maligní transformace). Kromě podpory buněčné proliferace se rovněž setkáváme s antiapoptotickým účinkem.

Dalším, velmi zajímavým mechanismem, kterým některé viry napomáhají transformačnímu procesu, je zvýšení telomerázové aktivity v buňce. Telomery jsou nukleoproteinové terminální části eukaryotních chromozomů, které hrají důležitou roli ve stabilitě příslušných chromozomů, a to především během buněčného cyklu. V průběhu každého dělení buňky se telomery zkracují (dle určitých, dnes většinou přijímaných teorií existuje přímý vztah mezi délkou telomer a stářím buňky; po určitém počtu dělení buňky by se tak buňka již dále nedělila). Enzym telomeráza umožňuje telomery prodlužovat a tím prodlužovat i další schopnost buňky dělit se. Telomerázová aktivita je fyziologicky v buňkách přítomna během prenatálního vývoje a v ojedinělých skupinách buněk (např. buňky hemopoetické řady) i během života jedince. V normálních somatických buňkách je telomerázová aktivita takřka nedetekovatelná.

V posledních třech letech byl objeven vztah mezi zvýšenou aktivitou telomerázy a infekcí lidským papillomavirem (HPV 16), herpesvirem HHV8 nebo EB virem. V genomu těchto virů však nebyla žádná komponenta telomerázy identifikována.

Prvním virem, u kterého byl objeven gen kódující subjednotku telomerázy (vTR), je MD (Marek's disease) virus, který způsobuje maligní T-lymfomy u kuřat.

Na konec ještě poznámka - přestože dnes již existují přesvědčivé důkazy o transformačním účinku některých virů - v konkrétním případě nádorového bujení u člověka nelze prokázat, že přítomnost viru v transformovaných buňkách byla opravdu onou příčinou maligní transformace.

V následující části budou blíže probrány nejvýznamnější onkogenní viry, způsobující maligní transformaci u člověka.

Významné lidské onkogenní viry

Lidský papillomavirus (HPV)

Viry > dsDNA viry > Papillomaviridae

Jedná se o DNA virus vyskytující se v mnoha různých subtypech (identifikováno více než 70 subtypů). Má vysokou afinitu k epiteliím kůže a sliznic a keratinocytům. Kromě toho, že způsobuje bradavice, je papillomavirus spojován s řadou benigních hyperplazií a tumorů a s některými vysoce maligními tumory - jakým je karcinom děložního čípku. Přenáší se tělesným kontaktem nakažených částí těla - nejčastěji při sexuálním styku, přičemž narušení integrity povrchu může přenos znatelně usnadnit.

Transformační aktivita jednotlivých subtypů se tedy liší - s mírnou dysplazií jsou většinou asociovány subtypy 6 a 11 (jsou identifikovány až v 90% případů genitálových bradavic); s těžšími maligními neoplaziemi jsou spojeny subtypy 16, 18, 31 a 33, 35 a 51 (některý z těchto subtypů nacházíme až u 85% případů karcinomu čípku děložního).

Transformační aktivita je pravděpodobně spojena s integrací virového genomu do genomu buňky. Zatímco v benigních hyperplaziích nacházíme virovou genetickou informaci v epizomech mimo buněčný genom, v případě karcinomů je virový genom integrován do buněčného genomu. Tato integrace je náhodná, avšak v případě mnohobuněčného karcinomu nacházíme virus integrován ve všech buňkách na stejném místě, z čehož lze usuzovat, že tato integrace předcházela klonální expanzi původní infikované - a následně transformované buňky.

Vlastní transformační účinek pravděpodobně obstarají produkty virových genů. Integrace virové genetické informace do buněčného genomu otevře čtecí rámec virového genu E2 a způsobí jeho transkripci. To následně způsobí zvýšenou expresi virového E6 a E7 genu. Virový protein E6 ovlivňuje buněčný protein p53, který buď inaktivuje nebo zajistí jeho zvýšenou degradaci, dále aktivuje telomerázu, inaktivuje inhibitor CDK p16(INK4) a interaguje i s dalšími buněčnými proteiny. Virový protein E7 interaguje s buněčným p105-Rb proteinem a narušuje jeho vazbu na E2F transkripční faktor, čímž odblokovává buněčný cyklus. Dále inaktivuje buněčný protein p21 (což vede ke stejnému účinku jako interakce s p105-Rb) a negativně ovlivňuje transkripční aktivitu buněčného TP53 genu. Objevují se přímo i mutace ve sktruktuře buněčného TP53 genu. Celkový účinek by se dal shrnout pod několik hesel: zvýšení proliferační aktivity, zablokování apoptózy, získání nesmrtelnosti, změny morfologické a zvýšení genetické nestability.

Na druhou stranu je třeba zmínit, že podle současných průzkumů je infekce (i potenciálně nebezpečným subtypem) papillomavirem pouze počátkem celého transformačního procesu a musí se vyskytnout další faktory, které jsou nezbytné pro dokončení transformačního procesu. Mezi tyto faktory patří například kouření, souběžné bakteriální infekce, špatná výživa nebo hormonální změny.

Jelikož karcinom děložního čípku je celosvětově druhou nejčastější (po rakovině prsu) příčinou úmrtí žen na nádorové onemocnění, existuje již delší dobu snaha o vyvinutí účinné očkovací látky proti určitým subtypům papillomaviru. Většina vyvíjených vakcín se snaží svým protektivním účinkem pokrýt zejména nejnebezpečnější subtypy HPV 16 a 18. Využívá se především imunizačního účinku virového L1 proteinu. Ačkoliv klinické studie běží již několik let a v některých zemích (včetně ČR) již byly zahájeny první zkušební programy na očkování obyvatelstva, existuje stále mnoho nezodpovězených otázek. Jelikož největší protektivní účinek lze očekávat u osob, které doposud nepřišly do kontaktu s HPV (který má schopnost v nakažených jedincích perzistovat po dlouhou dobu), provádí se očkování především u mladých dívek (řádově 16 - 26 let), které doposud neměly pohlavní styk (a tudíž se s HPV pravděpodobně doposud nesetkaly; u mladé - sexuálně aktivní dívčí populace lze HPV diagnostikovat až v 30% případů). Existuje možnost rozšířit očkování i na starší ženy, které rovněž dosud neměly pohlavní styk, nebo byly po delší dobu sexuálně zdrženlivé. Nicméně uvažuje se, že některé vakcíny by mohly mít i přímý "terapeutický efekt", kdy by i očkování sexuálně aktivní populace mohlo přinášet přínosné účinky.

Ačkoliv se mluví většinou pouze o očkování žen, u vakcín pokrývajících i spektrum subtypů HPV 6 a 11 (subtypy asociované se vznikem genitálových bradavic) by mělo jistě smysl očkovat i mužskou populaci. Nicméně tato varianta není zajisté tak aktuální jako očkování žen proti nebezpečným formám, spojených se vznikem karcinomu děložního čípku.

Rovněž je třeba si uvědomit, že karcinom děložního čípku je problémem především rozvojových zemí (odkud pochází až 80% případů tohoto onemocnění), ve kterých je zavádění plošného očkování většinou problematické, nejen z finančních důvodů (a finanční náklady na očkování proti HPV jsou stále poměrně vysoké).

Virus Ebsteina-Barrové (EBV)

Viry > dsDNA viry > Herpesviridae > Gammaherpesvirinae > Lymphocryptovirus

Patří mezi Herpesviry. Je znám jako původce infekční mononukleózy i jako virus spojený se vznikem řady nádorových onemocnění. Jedná se především o Burkittův lymfom, nazofaryngeální karcinom, různé Hodgkinovy i nehodgkinské nádory a snad i o některé nediferencované karcinomy žaludku.

Největší afinitu má EB virus k epiteliálním buňkám orofaryngu a B lymfocytům (méně pak i k T lymfocytům a NK buňkám). Do B lymfocytů proniká virus díky povrchové molekule CD21; replikuje se a způsobuje latentní infekci, kdy ve formě epizomů přetrvává v B lymfocytech (podle odhadů má tuto latentní infekci až 90% populace v ČR).

Transformační účinek EB viru je komplexní a není přímo spojený s inaktivací tumor-supresorových genů jako transformace HPV. Zahrnuje interakci řady virových proteinů s buněčnými molekulami, které vedou k immortalizaci a k transformaci infikovaných buněk.

Jmenujme alespoň aktivaci cyklinu D2 (člen rodiny SRC proteinů, aktivuje přechod buňky z G0 do G1 fáze), aktivaci antiapoptotického bcl-2 proteinu a aktivaci některých růstových faktorů (IL-6 a 10). Podobně jako u infekcí HPV nestačí samotná infekce k dokončení maligní transformace infikované buňky.

Burkittův lymfom je nádor z B lymfocytů, vyskytující se nejčastěji ve střední Africe a na Nové Guinei, kde tvoří nejčastější dětské nádorové onemocnění. Jedná se o první lidské nádorové onemocnění, u kterého byla prokázána souvislost s virovou infekcí.

Nacházíme zde jednu z nejznámějších chromozomových přestaveb u nádorových onemocnění a to sice translokaci mezi osmým a čtrnáctým chromozomem t(8;14). Při bližším průzkumu zjistíme, že při této translokaci je buněčný protoonkogen c-myc z 8. chromozomu přemístěn na chromozom č. 14, kde se dostává pod vliv aktivního promotoru genu pro těžký imunoglobulinový řetězec. Tato varianta chromozomální aberace se nachází přibližně v 75% případů; u zbylých přestaveb nacházíme zejména translokace t(2;8) a t(8;22), kde je c-myc přemístěn k promotoru genu pro kappa (respektive lambda) lehký řetězec imunoglobulinu.

Endemický i sporadický (mimo Afriku se vyskytující) Burkittův lymfom je často spojován s některou z těchto chromozomálních přestaveb. Až u 90% případů endemické varianty rovněž nacházíme genom EB viru, naopak u sporadického Burkittova lymfomu je genom EB viru identifikován sotva ve 20% případů.

Zdá se, že existuje spojitost mezi výskytem malárie v endemických oblastech střední Afriky a zvýšenou transformační schopností EBV infekce. Uvažuje se o určité "vyčerpanosti" imunitního systému malárií, díky které dostávají nesmrtelné a proliferačně aktivnější lymfocyty selekční výhodu.

V případě nazofaryngeálního karcinomu nacházíme genom EB viru údajně ve 100% případů. Tato infekce je endemická v oblasti jižní Číny a v některých afrických a arktických oblastech (sporadicky se vyskytuje celosvětově).

Viry hepatitidy B a C (HBV, HCV)

Viry > dsDNA Retroviry > Hepadnaviridae > Orthohepadnavirus (HBV)

Viry > ssRNA+ Viry > Flaviviridae > Hepacivirus (HCV)

Ačkoliv jsou taxonomicky odlišné (HBV = DNA virus; HCV = RNA virus), jelikož oba způsobují určitou formu virové hepatitidy a u obou je uvažována spojitost se vzniku karcinomu jater, budou popsány spolu.

U HBV existuje mnohem silnější podezření z transformačního účinku infekce než u HCV. Úloha HBV v procesu maligní transformace není stále zcela zřejmá, nicméně genom viru je izolovatelný z nádorových buněk téměř ve všech případech karcinomu jater spojeného s HBV infekcí. Podobně jako u infekcí HPV - i zde nacházíme genom viru integrovaný v genomu buněk (na stejném místě, což odpovídá klonální expanzi transformované buňky).

Dále jmenujme účinek virového Hbx proteinu, který ovlivňuje transkripci určitých buněčných genů (většinou jde o geny, jejichž produkty podporují buněčnou proliferaci) a může interagovat i s p53 proteinem. Transformace HBV virem je však pravděpodobně nepřímá a celkově multifaktoriální.

V případě HCV je transformační účinek podpořen pouze výsledky epidemiologických studií, z transformovaných buněk jeho genom izolován nebyl. U virových hepatitid typu C je obecně zvýšená proliferační-regenerační aktivita jaterních buněk, což je často dáváno do spojitostí s možným transformačním účinkem HCV infekce.

Pravděpodobně se zde rovněž uplatňuje multifaktoriální vliv - často zmiňovaný je například synergizmus HBV - HBC - aflatoxiny.

V případě HBV je třeba zmínit se o existenci účinné očkovací látky, která spolehlivě chrání před HBV infekcí a tím i před karcinomem jater touto infekcí způsobeným. Jedná se o první "protinádorovou" očkovací látku na světě.

Virus lidské T - buněčné leukémie (HTLV-1, HTLV-2)

Viry > ssRNA Retroviry > Retroviridae > Orthoretrovirinae > Deltaretrovirus

V obecné části byla uvedena řada retrovirů s prokazatelným onkogenním účinkem, ovšem pouze virus lidské T - buněčné leukémie (lymfomu) je spojen s častějším transformačním účinkem u lidí. Jako první byla identifikována HTLV-1 forma z kožního lymfomu; HTLV-2 forma byla identifikována později v Japonsku z vlasatobuněčné leukémie. Endemickými místy infekce je oblast jižního Japonska, dále karibská oblast a některé oblasti Afriky. Ve zbylých oblastech světa je výskyt sporadický (v Evropě byla infekce diagnostikována pouze u imigrantů).

Jedná se o klasický retrovirus, jehož transformační aktivita je pravděpodobně založena na účincích virového TAX proteinu (produkt virového TAX genu). Mezi tyto účinky patří inaktivace p16 proteinu, aktivace D2 cyklinu, zvýšení exprese některých buněčných genů podporujících proliferaci a snížení stability buněčného genomu. Tento retrovirus tedy neobsahuje onkogen, nýbrž podobně jako u DNA virů je onkogenní aktivita viru způsobena účinkem virového proteinu.

Lidský herpes virus 8 = virus Kaposiho sarkomu (KSHV)

Viry > dsDNA viry > Herpesviridae > Gammaherpesvirinae > Rhadinovirus

Jedná se o herpesvirus, který je asociovaný s výskytem Kaposiho sarkomu zejména u jedinců s imunosupresivní léčbou nebo imunodeficitem (v popředí s AIDS). Existují však i endemické (v Africe) či sporadické formy Kaposiho sarkomu.

Ačkoliv je genom KSHV izolovatelný téměř ze všech nádorových buněk, existuje stále mnoho nezodpovězených otázek ohledně transformačních mechanizmů. Je téměř jisté, že infekce KSHV je sama o sobě nedostatečná k transformaci buňky a je třeba dalších kofaktorů.

Zdá se, že takovým kofaktorem může být například imunosuprese u HIV infekce, či samotná infekce HIV (potom se ovšem nabízí otázka, co je oním kofaktorem u HIV negativních jedinců s Kaposiho sarkomem).

Jako možné transformační mechanizmy KSHV je uváděn homolog cyklinu D virového původu a různé inaktivátory p53 proteinu.

Další onkogenní viry

V této kapitole uvedu několik virů, u nichž není přímý onkogenní účinek prokázán, uvádějí se však jako "kofaktory" transformační aktivity jiných virů. Nicméně i klasifikace viru jako nádorového kofaktoru je problematická, neboť se většinou jedná o viry, u kterých nelze přímý onkogenní účinek prokázat a jsou uváděny spíše z hlediska "setrvačnosti" některých autorů, i když přímý onkogenní účinek je již přisuzován jinému viru.

Na pomyslných stranách hranice mezi onkogenními viry a jejich kofaktory tvoří HCV, u nějž se nyní autoři přiklánějí k přímému účinku a HIV, u kterého se spíše počítá s nepřímým účinkem navozením imunodeficitu - viz dále.

Na závěr této kapitoly se krátce zmíním i o problematice zvířecích onkogenních virů.

Virus lidského imunodeficitu (HIV)

Viry > ssRNA Retroviry > Retroviridae > Orthoretrovirinae > Lentivirus

Tento retrovirus je znám jako původce AIDS u lidí. Tento syndrom je spojený i s výskytem určitých nádorových onemocnění (jde například o Kaposiho sarkom, některé nehodgkinské B-lymfomy a karcinomy děložního čípku či rekta).

Přesto se zdá, že přímý onkogenní potenciál HIV nemá a za transformaci jsou odpovědné jiné viry (KSHV, EBV respektive HPV), přičemž HIV pouze "usnadňuje práci" navozením imunodeficitu.

Virus Herpes simplex typ II (HSV-2)

Viry > dsDNA Viry > Herpesviridae > Alphaherpesvirinae > Simplexvirus

U tohoto viru se předpokládala asociace s karcinomem děložního čípku, kde měl působit jako kofaktor HPV. Pravděpodobně je to však pouze HPV, který má přímou transformační aktivitu.

Lidský Cytomegalovirus (HCMV)

Viry > dsDNA Viry > Herpesviridae > Betaherpesvirinae

Zde se předpokládal pomocný účinek při vzniku Kaposiho sarkomu (a rovněž karcinomu čípku děložního). Momentálně se hlavní úloha při vzniku Kaposiho sarkomu přisuzuje KSHV.

Onkogenní viry u zvířat

Virů s prokazatelným onkogenním účinkem je celá řada, tato práce je však psána s ohledem na lékařskou mikrobiologii, a proto zde byly rozebrány pouze nejvýznamnější viry z hlediska lidské medicíny.

Pokud budeme zjišťovat i onkogenní potenciál některých virů na zvířecích modelech, dojdeme k dalším rozsáhlým objevům a závěrům.

Pro zajímavost se odvolávám na výčet rychle transformujících retrovirů v obecné části této práce, dále vzpomeňme různé adenoviry, které mají u zvířat vysokou transformační aktivitu. Onkogenně u zvířat působí i některé polyomaviry, včetně lidského polyomaviru JC.

Seznam použité literatury

1. Adam Z., Vorlíček J., Koptíková J.; Obecná onkologie a podpůrná léčba; Grada; Praha; 2003
2. Kumar V., Abbas A. K., Fausto N.; Robbins and Cothran pathologic basis of diseases. 7th edition; Elsevier Saunders; Philadelphia; 2005
3. Baron S.; Medical microbiology. 4th edition; The university of Texas Medical Branch at Galveston; Galveston; 1996 [online: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/]
4. Kapras J., Kohoutová M., Otová B.; Kapitoly z lékařské biologie a genetiky I; Karolinum; Praha; 1996
5. Hunt R.; Microbiology and Immunology on-line, Virology - Chapter six, Oncogenic Viruses; University of South Carolina, School of Medicine; [online: http://pathmicro.med.sc.edu/lecture/RETRO.HTM; stav k 5. 10. 2006]
6. Fragnet L., Kut E., Rasschaert D.; Comparative Functional Study of the Viral Telomerase RNA Based on Natural Mutations; The Journal of Biological Chemistry; 280; 25; pp. 23502 - 23515 [online: http://www.pubmed.com/]
7. Lowy D., Schiller J.; Prophylactic human papillomavirus vaccines; The Journal of Clinical Investigation; 116; 5; pp. 1167 - 1173
   [online: http://www.pubmed.com/]
8. Oliveira L., Rodrigues E., Lopes A., Fernandez A., Cavalcanti S.; HPV 16 detection in cervical lesions, physical state of viral DNA and changes in p53 gene; Sao Paulo Medical Journal; 2; 2; pp. 67 - 71 [online: http://www.pubmed.com/]