Genetické testy

Genetické testování; testy DNA a podobné pojmy se pomalu staly běžnou součástí nejen odborných textů, ale pronikly i do médií a běžného podvědomí nás všech. Přitom samotný pojem genetického testu je velice široký a leckdy nejde jen o test DNA. Za účelem lepší orientace v záplavě různých termínů byla vytvořena tato kapitola.

Genetické testy v rámci prenatální diagnostiky

Testování ještě nenarozeného jedince zaujímá specifické místo ve schématu zdravotní péče. Některé základní pojmy a informace k této problematice najdete v kapitole Genetické poradenství, nebudu je proto zde zmiňovat.

Úplně nejčastějším "genetickým vyšetřením" je ve skutečnosti vlastně vyšetření biochemické. V rámci tzv. biochemického screeningu, který se zpracovává z periferní krve odebrané budoucí matce, se určuje případné zvýšené riziko vybraných vrozených vad. Nejedná se ovšem o genetické vyšetření, ačkoliv matky často říkají "brali mi krev na genetiku" apod.

Dalším vyšetřením ve schématu prenatální diagnózy je vyšetření karyotypu plodu. Materiál se získává pomocí některé invazivní metody, ať již amniocentézy, biopsie choriových klků či kordocentézy. Vyšetření karyotypu je genetické vyšetření, přesněji vyšetření cytogenetické (neboť se vyšetřují chromozomy), ovšem nejedná se o test DNA.

Novinkou v této problematice (vyšetření karyotypu) je tzv. Amnio-PCR (odnož metody QF-PCR; o metodě PCR viz kapitola Rekombinantní DNA). Zde se jedná o molekulárně genetické vyšetření, kde opravdu testujeme DNA. Vyšetřují se specifické markery na několika chromosomech (jedná se o chromozomy, jejichž aneuploidie – nesprávný počet – se v patogenezi chromozomálních aberací uplatňují nejčastěji – tedy 13, 18, 21, X a Y; možné jsou mírné obměny). Hodnotí se počet (respektive poměr) těchto markerů v získaném vzorku – lze tak odhalit změny v počtu těchto chromozomů, například trizomii apod. Výhodou tohoto vyšetření je jeho rychlost (oproti klasickému vyšetření karyotypu), ovšem pro svou značnou omezenou vypovídací hodnotu při identifikaci jiných typů abnormalit je nutné toto vyšetření vždy doplnit i klasickým cytogenetickým vyšetřením.

Testy DNA se v prenatální diagnostice provádějí méně často, ovšem i s nimi se lze běžně setkat. Indikacím k takovýmto testům je prokázané nosičství mutace (viz kapitola Mutace) příslušného genu u některého z rodičů dítěte. Materiál k těmto testům je opět nutné získat pomocí některé z invazivních metod prenatální diagnostiky. Jedná se potom o standardní test DNA, prováděný za účelem potvrzení či vyvrácení přítomnosti hledané mutace v DNA plodu (respektive zda jde o heterozygotní či homozygotní kombinaci apod.).

Postnatální genetické testy

Po narození člověka je genetické testování o poznání snadnější. Především odpadá potřeba složitých invazivních metod pro získání vzorku. Většinou si vystačíme s pouhým odběrem periferní krve, čímž získáme vhodný materiál jak pro molekulárně genetické, tak pro cytogenetické vyšetření. Dnes se pro molekulárně genetické vyšetření stále častěji používá i stěru z bukální sliznice, který je zcela neinvazivní a je snadno proveditelný i neodborníkem (nesmí však vzorek kontaminovat). Po narození a vůbec v dospělosti se nabízí spousta možností jak a hlavně proč testovat. Testuje se z medicínských důvodů, testuje se z forenzních důvodů a dnes se testuje i z důvodů osobních, či tzv. rekreačních.

Vyšetření karyotypu

Téma vyšetření karyotypu a jeho indikace bylo již zmíněno v kapitole Chromozomy. Karyotyp je ověřován například z důvodu podezření na některý ze syndromů (viz. Chromozomální aberace), při podezření na nosičství balancované translokace či při poruchách sexuálního vývoje, neplodnosti nebo po několika spontánních potratech (vyšetřujeme oba partnery). K vyšetření samotnému jsou nejčastěji využity bílé krvinky z odebrané krve, které se ve speciálním médiu pomnoží, jejich dělení je poté přerušeno a po nabarvení jsou chromosomy připravené k pozorování v mikroskopu a vyhodnocení.

S rozvojem molekulární cytogenetiky (která vznikla díky zavedení molekulárně-genetických metod do cytogenetiky) se otevřela cesta k novým způsobům detekce mikrodelecí a jiných chromosomálních mutací malého rozsahu, které byly předtím jen obtížně detekovatelné. Metoda FISH (fluorescentní in situ hybridizace) je založena na hybridizaci fluorescentně značené sondy se svým cílovým místem na příslušném chromosomu. Sonda ve fluorescenčním mikroskopu barevně září. Navržena může být tak, že pokrývá specifický úsek či sekvenci, ale třeba i celý chromosom (využitelné pro detekci komplexních přestaveb karyotypu v cytogenetice nádorových buněk).

Obrázek 1 - Pomocí specializovaných FISH sond lze znázornit jednotlivé chromozomy v karyotypu.

Vyhledávání genových mutací

V rámci genetiky člověka již bylo identifikováno obrovské množství monogenně dědičných chorob (viz Genetické choroby). Aktualizovaný seznam genů a monogenních chorob nabízí databáze OMIM. V klinické praxi se však na přítomné mutace rutinně vyšetřuje pouze malá část z těchto genů. Rovněž spektrum vyšetřovaných mutací je zpravidla menší, než počet všech známých mutací v konkrétním genu. To je do jisté míry způsobeno známým fenoménem, kdy výzkum jde mílovými kroky dopředu, ovšem jeho aplikace do klinické praxe je velmi zpomalená (hlavně z příčin ekonomických). Řada genů, mutací a polymorfismů objevených v experimentu má navíc stále klinicky ne zcela jasný význam a proto jejich testování není zatím přínosné. Pro klinickou genetickou praxi většinou stačí vyšetření základních mutací u nejčastějších geneticky podmíněných chorob. Pro ověřování vzácnějších mutací je třeba vyhledat takovou laboratoř, která patřičné vyšetření nabízí (často je nutné kontaktovat zahraniční laboratoře; celosvětovou databázi laboratoří najdete na stránce www.geneclinics.org).

Vyšetření samotné je založené na izolaci DNA ze vzorku, která se většinou namnoží pomocí metody PCR (pro bližší popis této a dalších metod – viz kapitola Základní metody genetického inženýrství). Pro vlastní identifikaci mutace je pak možné použít metody přímé či nepřímé DNA diagnostiky. Nabízí se možnost alelově specifické PCR, RFLP, HA, DGGE, TGGE, SSCP, přímé sekvenaci konkrétního genu aj.

Důležité je, že takovéto genetické testování musí být vázáno na kvalitní genetické poradenství. Testovaný jedinec musí být poučen o přínosu testu, jeho výpovědní hodnotě a o možnostech dalšího postupu v případě pozitivního výsledku testu.

Z etického hlediska je nesprávné tímto způsobem testovat malé děti, pouze na přání rodičů. Každý člověk by měl mít právo se svobodně rozhodnout, zda si takovýto test přeje, či nikoliv (ne každý si přeje vědět, že má vysoké riziko vzniku určitého typu rakoviny). V případě nemocí, u kterých nehrozí riziko z prodlení, by se měly testovat až osoby od 18, případně alespoň od 15 let věku (kdy už jsou tyto osoby schopné pochopit důsledky takovéhoto testu). Naopak u takových chorob, kde je možné časnou diagnostikou zamezit dalšímu poškození jedince, jsou tyto testy plně opodstatněné i u malých dětí (jedná se především o různé poruchy metabolismu).

Poznámka: Pozitivní výsledek testu v biomedicínském výzkumu a praxi znamená, že bylo nalezeno to, co se hledalo. Pokud tedy testujeme pacienta na určitou mutaci, potom pozitivní výsledek testu znamená, že testovaný tuto mutaci má (a z hlediska psychologického je pro něj výsledek testu vlastně negativní).

Testování genotoxicity

Pro ověřování genotoxických (mutagenních) účinků různých vnějších faktorů existuje skupina specializovaných testů. Ověřuje se jak mutagenní potenciál samotných látek (např. chemikálií) – in vitro, tak i současný stav jedince po expozici mutagenům – testy in vivo.

Amesův test je klasickým testem pro stanovení mutagenního potenciálu různých chemikálií. Původní provedení tohoto testu počítá se speciálním kmenem bakterie Salmonella typhimurium, který má mutovaný gen, jež bakterii umožňuje syntetizovat aminokyselinu histidin. Jelikož bakterie roste na živné půdě, která tuto aminokyselinu neobsahuje, nemá bakterie k této aminokyselině přístup a nepřežívá. Test probíhá tak, že tento kmen bakterie je vystaven působení zkoumané látky. Poté je sledován růst těchto kolonií na oné živné půdě bez histidinu. Procento přežívajících kolonií ukazuje na mutagenní potenciál zkoumané látky – nastane totiž "mutace mutace" – tedy zpětná mutace, kdy vlastně dojde k opravě původně defektního genu, čímž bakterie získá opět schopnost syntetizovat histidin (a přežít).

Test ZCHA (ZCA), neboli Získaných Chromozomálních Aberací nám umožňuje zhodnotit vliv mutagenů na struktury in vivo. Provedení testu je velmi jednoduché. Po odběru periferní krve a kultivaci získaných lymfocytů hodnotíme procento aberantních buněk, tj. buněk s chromosomální aberací. Tato metoda informuje o expozici vyšetřovaného jedince mutagenům v průběhu několika posledních měsíců. Hodnoty zhruba do 3% jsou normální, mezi 3% a 5% hraniční a nad 5% vysoké. Toto vyšetření se může provádět například i v rámci preventivních prohlídek zaměstnanců pracujících v prostředí s vyšším rizikem genotoxicity.

Dalšími metodami v genotoxikologii jsou:

Comet assay (kometový test) - spočívá v elektroforéze celých buněk, přičemž malé fragmenty jaderné DNA (které vznikly působením mutegenních faktorů) mají tendenci vycestovat z jader, což po vizualizaci dává výsledek obrazu komety.

Sister chromatid exchange (výměna sesterských chromatid) - spočívá v pozorování výměn genetického materiálu mezi sesterskými (identickými) chromatidami (což je umožněno různým barvením), které je úměrné expozici genotoxické látky.

Micronucleus test (mikrojádrový test) - spočívá v pozorování fragmentovaného jaderného materiálu, tzv. mikrojader, které vznikly působením genotoxických faktorů.

Testy ve forenzní genetice

Testy DNA mají dnes své místo i v kriminalistice a soudním lékařství. Genetické metody dnes nabízejí dříve netušené možnosti v oblasti identifikace osob, nicméně ne vše funguje vždy tak snadno jako v televizních seriálech. Například kontaminace materiálu či jeho nedostatek, respektive nevhodnost pro genetickou analýzu, mohou způsobit, že i ty nejlepší metody selžou. S namnožením genetického materiálu pro analýzu pomáhá metoda PCR.

V rámci identifikace osob a určování příbuzenského poměru (viz testy otcovství níže) se využívá tzv. STR (Short Tandem Repeats) – krátkých tandemových repetic (někdy označované jako mikrosatelity). Jde o specifické sekvence DNA, které se vyskytují (ve velkém množství) rozptýlené v genomu. Jedná se o repetice (nejčastěji CA dvojice nukleotidů) jejichž počet opakování v konkrétním lokusu je pro každého jedince specifický. Konkrétní počet repetic se zjistí díky metodě PCR a následné elektroforéze fragmentů. Lze tedy vytvořit spolehlivý genetický profil jedince. Přesnost je velmi vysoká – hovoří o tom jak neoficiální název této metody (DNA fingerprinting – doslova genetické otisky prstů), tak skutečnost, že jde o soudy běžně uznávaný důkaz.

Základní dva úkoly forenzní genetiky jsou identifikace pachatele a identifikace oběti. Pro identifikaci pachatele lze použít veškerý genetický materiál (krev, vlasy, sperma…), zanechaný na místě činu, na těle oběti apod. Genetický profil takto získaného vzorku je třeba porovnat s materiálem získaným od podezřelého, či z DNA registru pachatelů (je-li v příslušné zemi zřízen).

Pokud není možná identifikace těla oběti standardními metodami (vizuální identifikace, otisky prstů, zubní karta aj.), je možné použít test DNA (opět za předpokladu, že lze zajistit dostatečné množství genetického materiálu vhodného pro analýzu). K porovnání je třeba nalézt vzorek DNA prokazatelně patřící oběti, nejčastěji zanechaný na osobních předmětech (hřeben, oděv, hygienické potřeby…). V případě, že takovýto vzorek nelze zajistit, je možné porovnat vzorek DNA oběti se vzorkem od některého z příbuzných (musí jít samozřejmě o pokrevního příbuzného).

Poznámka: získávání materiálu pro test DNA z mrtvých těl není výsadou pouze forenzní genetiky. I v klinické genetické praxi je občas nutné (v rámci komplexního vyšetřování širší rodiny; k tomuto postupu se přistupuje zejména u rodinného výskytu nádorového onemocnění s možnou dědičnou příčinou) požádat o vzorek tkáně zemřelého (s takovou žádostí je nutné se obrátit na patologický ústav, kde byl zemřelý pitván, a kde je šance, že byly uloženy tkáňové bločky určené pro histologické vyšetření); pokud však nebyla provedena pitva či nebyly uschovány vzorky tkáně, potom nezbývá než se bez vzorku tohoto jedince obejít.

Testy otcovství

Tímto názvem se označuje nejčastěji prováděná varianta příbuzenských testů. Vychází ze starého známého pravidla – matka je vždy známá, otec je neznámý. Nicméně v potřebném případě (třeba při identifikaci biologické matky adoptovaného dítěte) lze tento typ testů provést i jako "test mateřství". Princip je totiž stejný a většinou odpovídá výše uvedenému genetickému profilu, získaného pomocí PCR amplifikace STR repetic. Jelikož potomek získává polovinu své celkové genetické informace od každého z rodičů, můžeme vysledovat, po kterém rodiči má které STR repetice. S každým z rodičů by měl potomek mít právě 1/2 shodné DNA (v tomto případě STR repetic). Pokud analýza prokáže, že rodič nemá s potomkem shodné STR repetice – je otcovství (respektive mateřství) vyloučeno.

Testy otcovství jsou dnes běžně nabízeny řadou soukromých firem (více či méně) specializovaných na genetické testování. Test stojí několik tisíc korun a je běžné provést jej anonymně. Testovací sadu (obsahující nejčastěji pomůcky k provedení bukálního stěru pro dvě osoby – dítě a testovaného rodiče) je možné objednat si přes internet a materiál k vyšetření je možné zaslat poštou. To sice zvyšuje komfort zákazníka, při špatném zacházení ale může dojít ke kontaminaci vzorku. Obecně je (vzhledem k závažnosti možných následků testu) dobré na tomto testu nešetřit a raději si zaplatit dražší test, ovšem u certifikované firmy, která má v této oblasti již určité zkušenosti.

Etická otázka těchto testů je problematická. Testy otcovství mají totiž řadu odpůrců, kteří tvrdí, že podobné testy vedou často k rozvratu jinak spokojených rodin. Na druhou stranu je nutné si uvědomit, že jedinou vadou správně provedeného testu otcovství je ta skutečnost, že dokáže odhalit pravdu.

Obrázek - Výsledek genetického prfilování (od 6 různých osob) používaný v testech paternity či forenzní genetice.

Genografické testy

Jde o relativní novinku v oblasti genetického testování. Tyto testy, které lze objednat u soukromých firem, mají přiblížit území, ze kterého nejpravděpodobněji pocházel váš předek a další doplňující informace. Praktické využití této informace není velké (ačkoliv v budoucnosti možná i tyto informace budou přínosem pro personalizovanou medicínu), ovšem pro zájemce (genealogy či antropology, byť jen amatérské) může mít cenu velkou.

Pro tyto testy je zapotřebí izolovat z DNA takové sekvence, které se za mnoho století relativně nezměnily, a jejichž přenos z rodičů na děti po mnoho generací dnes funguje jako pojítko s minulostí.

U mužské linie se používá několik vybraných haplotypů z chromosomu Y. Tento chromosom se dědí výhradně z otce na syna a tyto sekvence zůstávají v průběhu generací (téměř) neměnné.

U žen je možné stopovat mitochondriální DNA (mtDNA), která se pro změnu dědí pouze po matce (dostávají ji všechny děti oné matky).

Obrázek - Předpokládané směry migrace člověka zjištěné na základě genografických studií

Prediktivně-genetické testy

Prediktivní genetika je odvětví genetiky specializující se na odhad rizik (určitých chorob) na základě vyšetření DNA. V budoucnosti se dá očekávat, že by na základě komplexního genetického vyšetření bylo možné předpovědět riziko vzniku určitých multifaktoriálně dědičných chorob (jako jsou choroby kardiovaskulárního systému apod.).

Již dnes je možné si podobné testy u některých firem objednat. Řada vědců a odborných společností ovšem upozorňuje, že problematika komplexních chorob je stále nedořešená. Výpovědní hodnota takovýchto testů je tedy nejistá a odborníci před nimi prozatím varují.

Mikrobiologické testy

Na závěr je vhodné zmínit se o genetických testech, využívaných v klinické mikrobiologii. Diagnostika různých patogenních mikroorganismů pomocí molekulárně-genetických metod (nejčastěji pomocí metod PCR, LCR aj.) výrazně urychlila diagnostiku některých chorob, respektive přítomných patogenů. Na druhou stranu, při klasické kultivaci bakterií na agaru lze rovnou zjistit citlivost patogenu na antibiotika, což metoda PCR nedokáže.